Forexpros System 96 Genauigkeit Präzision

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Während mehrere kommerziell verfügbare Instrumente diese Spotting-Aufgabe automatisiert haben, werden die Probenpräparation, die Kulturvermehrung und die Erhaltung der DNA-Bibliothek oft manuell mit Mehrkanalpipetten in Formaten mit 8 × 12, 96 Vertiefungen oder 16 × 24, 384 Vertiefungen durchgeführt. Manuelle Mehrkanalpipetten sind zwar effizienter als Einkanalpipetten, stellen aber dennoch ein großes Pipettierpotenzial mit vielen Möglichkeiten für Pipettierfehler dar. Hier beschreiben wir die Verwendung des automatischen Pipettiersystems Precision 2000 TM, um viele der erforderlichen Pipettieraufgaben für die Probenvorbereitung für die Mikroarray-Spotting durchzuführen. Diese Schritte umfassen die Vermehrung von Plasmidbibliotheken, die PCR-Reaktionsvorbereitung, die Behandlung von PCR-Produkten für die Agarosegelelektrophorese und die Rekonstitution von lyophilisierten Proben vor der Mikroarray-Spotting. Die Precision 2000 verfügt über eine vollständig konfigurierbare Sechs-Stationen-Plattform, die die erforderlichen Pipettenspitzen, Reagenzrinnen und Mikroplatten (96- und 384-Well) für den Flüssigkeitstransfer hält. Die Plattform ist herausnehmbar und ermöglicht mehrfache Benutzerfreundlichkeit, einfache Reinigung und Einrichtung des Instruments. Der 8-Kanal-Pipettenarm bewegt sich nach oben und unten sowie seitlich, während die Plattform von vorne nach hinten bewegt, um einen kompletten Zugang zu allen Stellen auf der Arbeitsplattform und vollständiger Konfigurierbarkeit zu bieten. Der Pipettenarm verwendet eine proprietäre Technologie, um zuverlässig jede Standardspitze aufzuheben und zu versiegeln, mit einzelnen, frei schwimmenden Fässern, die Spitzen aus Position heraus kompensieren. Ein optionaler Schnellverteiler mit 8 Kanälen, der eine präzise, ​​bidirektionale Spritzenpumpe verwendet, um Flüssigkeiten aus einem großen, drucklosen Vorratsbehälter genau und schnell abzugeben, ist ebenfalls erhältlich. Der Precision 2000 verfügt über einen eingebauten Mikroprozessor, der alle Bewegungen steuert. Die flexible Software, sowohl Onboard als auch PC-basiert, bietet vollständige Programmiermöglichkeiten. Für eine vollständigere Automatisierung können Robotik-Schnittstellen mit ActiveXreg Software-Befehlen entwickelt werden. Die Precision 2000rsquos klein, mit einem 15 x 21-Zoll-Fußabdruck und einer Höhe von 16 Zoll, ermöglicht es fast überall verwendet werden, einschließlich der meisten biologischen Sicherheit Schränke oder chemische Dunstabzugshauben. BioTek Precision 2000 Automatischer Mikrotiterplatten Pipetting System MJ Research Thermocycler Qiagen BioRobot 3000 BioRobotics Microarray-Spotter Savant Lyophilizer BioTek Powerwave X Mikroplatten-Spektralphotometer Materialien und Methoden Um die Genauigkeit 2000 Low-Volume-Pipettieren Fähigkeiten, konzentrierte Farbstofflösungen wurden zur Bestimmung verzichtet die Präzision 2000. Bei der Verwendung von Wurden einige Experimente mit einer blauen Farbstofflösung in TRIS-Pufferverdünnungsmittel in saubere trockene Platten (entweder 96-Vertiefung oder 384 Vertiefungen) abgegeben und farbloses TRIS-Pufferverdünnungsmittel zugegeben. Die resultierende Extinktion wurde dann bei 595 nm unter Verwendung eines Mikroplatten-Absorptionslesers abgelesen. In anderen Experimenten wurde gelber Farbstoff zu den Vertiefungen gegeben, die bereits das Verdünnungsmittel enthielten. In diesen Experimenten enthielten sowohl der Farbstoff als auch der farblose Puffer auch 0,1 Tween 20 Tensid. Nach der Zugabe der wässrigen Lösungen wurde die Absorption jeder Vertiefung der Platte bei 450 nm unter Verwendung eines PowerWave X-Absorptionslesers (BioTek Instruments, Inc. Winooski, VT) bestimmt. Die Daten aus beiden Experimenten wurden dann in Microsoftreg Excel exportiert und die Datenreduktion durchgeführt. Die Genauigkeit wurde unter Verwendung entweder eines gravimetrischen Verfahrens oder der Verdünnung des Farbstoffs bestimmt. Die Bestimmung unter Verwendung des gravimetrischen Verfahrens erfolgte durch Wägen von Platten, die mit 100 mul PBS unter Verwendung einer Analysenwaage vorgefüllt wurden. Nach dem Abgeben der geeigneten Flüssigkeit auf die Platte mit dem Precision 2000 wurde die Platte schnell wieder gewogen. Die resultierenden Gewichtsveränderungen, wenn sie durch die Anzahl der Plattenvertiefungen geteilt wurden, lieferten ein durchschnittliches pro Volumen abgegebenes Volumen zurück. Bei der Berechnung der Dosiergenauigkeit unter Verwendung des Farbstoffverfahrens wurde konzentrierter gelber Farbstoff mit Precision 2000 in vorgefüllte Platten pipettiert. Nach dem Mischen auf einem Orbitalschüttler für 60 Sekunden wurde die Absorption auf einem PowerWave X-Mikroplatten-Spektrophotometer (BioTek Instruments, Inc.). Die resultierenden Extinktionswerte wurden mit einer vorher vorhandenen Eichkurve verglichen und das Abgabevolumen interpoliert. Das Precision 2000 automatisiertes Pipettiersystem führt viele der routinemäßigen Pipettieraufgaben durch, die mit der Probenvorbereitung für die Mikroarray-Spotting verbunden sind. Die Präzision 2000 kann auf jeder stabilen Laborfläche, einschließlich Standard-Laborbänke, sowie mobile Wagen installiert werden. Der geringe Platzbedarf erlaubt sogar den Einsatz im Biosicherheitsschrank. Der Precision 2000 kann mit Precision Powerauml Software auf einem angeschlossenen PC programmiert werden. Nachdem die Programmierung abgeschlossen ist, werden die notwendigen Dateien auf das Gerät heruntergeladen und das Precision 2000 kann eigenständig laufen. Diese Eigenschaften bieten folgende Vorteile: Das System lässt sich schnell und einfach an verschiedene Standorte bewegen und einen zuverlässigen Betrieb gewährleisten. Der Endbenutzer kann das System nach Bedarf neu programmieren, ohne dass eine Neuinstallation oder Programmierung erforderlich ist. Zwar gibt es zahlreiche Aufgaben, die von der Precision 2000 durchgeführt werden können, hier sind Beschreibungen einiger der von der Precision 2000 durchgeführten Aufgaben. Beachten Sie, dass der grau hinterlegte Text die Aufgaben anzeigt, die nicht von Precision 2000 durchgeführt wurden 2: Deck Layout von Precision 2000 für Hefe Kultur PCR-Setup. Die Präzision 2000 überträgt 80 Mikroliter PCR-Mastermischung, die Polymeraseenzym, Primer und Desoxynukleotide enthält, in alle Vertiefungen einer 96-Loch PCR-Platte (orange Schattierung) aus dem Reagenztrog (gelbe Schattierung) unter Verwendung von Standardpipettenspitzen (grüne Schattierung). Unter Verwendung von Aerosolbarrierenspitzen (blaue Schattierung) überträgt das Precision 2000 20 & mgr; l Hefekultur in tiefe Wannenplatten auf die 96-Loch-PCR-Platte (orange Schattierung). PCR-Platten werden manuell auf einen MJ Research-Thermocycler übertragen, wobei ein primer-spezifischer Thermocylinglauf durchgeführt wird. Abgeschlossene PCR-Reaktionen werden dann auf einen Qiagen 3000 BioRobot zur PCR-Produktbereinigung übertragen. Nach der Primer - und Nukleotidentfernung werden die PCR-Reaktionen bis zur Trockene mit einem Savant-Lyophilisator lyophilisiert. Nach der Lyophilisierung werden die Proben in 20-25 Mikrolitern destilliertem Wasser unter Verwendung des Precision 2000 resuspendiert. Für eine kompaktere Lagerung werden Proben von vier 96-Well-Platten auf eine 384-Well-Mikroplatte übertragen und bei ndash20ordmC bis ndash80ordmC gelagert, bis sie benötigt werden. Unmittelbar vor dem Auftauen werden dann Proben aufgetaut und ein gleiches Volumen an 2fachem Spotting-Puffer (enthaltend Salze und DMSO) unter Verwendung des Precision 2000 zugegeben. Die Proben werden dann unter Verwendung eines BioRobotics Microarray-Spotting-Roboters entdeckt. PCR Check-Gel Probenvorbereitung Abbildung 3: Precision 2000 Deck Layout für die Gelprobenvorbereitung. Unter Verwendung von Aerosolspitzen (blaue Schattierung) transportiert die Precision 2000 4 ml Probe aus den Vertiefungen der Qiagen-Sammelplatte zu den entsprechenden Vertiefungen einer runden Bodenplatte. Unter Verwendung normaler Spitzen (grüne Schattierung) werden 5 ml Gelbeladungspuffer zu den Proben in der runden Bodenplatte gegeben und mit dem Precision 2000 gemischt. Abbildung 4: Nahaufnahme des Pipettenarms mit Spitzen. Die Proben werden von einer 96-Vertiefung in eine 384-Well-Mikroplatte übertragen. Ergebnisse der Precision 2000-Niedervolumen-Pipettierung Wie in 5 gezeigt, wurden, wenn wässrige Lösungen in trockene Platten verteilt wurden, große Well-to-Well-Unterschiede mit sehr kleinen Volumina (weniger als 3 & mgr; l) beobachtet. Der Variationskoeffizient (CV) für eine Platte mit einer 1-mul-Abgabe wurde so groß wie 60. Jedoch verringern sich die Well-to-Well-Unterschiede schnell mit zunehmendem Abgabevolumen. Abgabevolumen, die so klein wie 3 mul sind, haben einen CV-Wert von weniger als 4. Wenn kleine Flüssigkeitsvolumina in 384-Well-Platten ausgegeben werden, wird ein ähnliches Muster der Well-to-Well-Variation beobachtet (Abbildung 6). Bei der Abgabe in trockene 384-Lochplatten werden sehr große Unterschiede zwischen den Vertiefungen bei 1-2 & mgr; m beobachtet. Allerdings zeigen Dosiervolumen größer als 3 mul hervorragende Ergebnisse. Wenn kleine wässrige Volumina in partiell gefüllte Plattenvertiefungen verteilt werden, wird eine deutliche Verbesserung der Präzision beobachtet (Abbildung 7). Auf Volumina von nur 1 Mul kann mit einem Abweichungskoeffizienten von weniger als 4 verzichtet werden Gut oder grßer ist, ist der CV routinemßig weniger als 2. Das Muster der erhöhten Präzision mit Abgabevolumina von 3 & mgr; m oder mehr ist in der Natur ähnlich, wie es beim Abgeben in trockene Bohrlöcher beobachtet wird. Jedoch wird der Grad der Verbesserung als Ergebnisse der stark verbesserten Ergebnisse bei 1-2 & mgr; m Abgabevolumen (2-3,5 gegenüber 30-60 CVs) verringert. Wie in Abbildung 8 gezeigt, ermöglicht die Precision 2000rsquos Rapid Dispense Mode Option eine präzise Abgabe von Flüssigkeiten. Unter Verwendung einer 96- oder einer 384-Well-Platte können Volumina, die so klein wie 10 & mgr; mul sind, aus dem Massenreagens-Abgabeverteiler abgegeben werden. Beim Verteilen von 10 mul in eine Plattenvertiefung scheint es, dass die 384-Well-Platte eine bessere Präzision bietet. Jedoch scheint bei Volumina von 20 & mgr; l oder mehr ein geringer Unterschied zwischen den verschiedenen Plattenmatrizen zu bestehen (8). Abbildung 5: Dosiergenauigkeit in trockene 96-Loch-Platten mit der Precision 2000-Pipette bei verschiedenen Dosiervolumina. Das angegebene Volumen von TRIS-Puffer, der eine blaue Lebensmittelfärbung enthielt, wurde in alle Vertiefungen einer Platte mit 96 Vertiefungen unter Verwendung der Pipette abgegeben. Nach dem Abgeben des gefärbten Farbstoffs wurden 100 Mikrolol TRIS-Puffer in jede Vertiefung unter Verwendung des Abgabeverteilers mit einer Geschwindigkeitseinstellung von 5 abgegeben. Die Extinktion bei 595 nm für jede Vertiefung jeder Platte wurde unter Verwendung eines Mikroplatten-Absorptionslesers bestimmt. Beachten Sie, dass jede Datenleiste die CV einer ganzen Platte darstellt. Abbildung 6: Dosiergenauigkeit in trockene 384-Well-Platten mit der Precision 2000-Pipette bei verschiedenen Dosiervolumina. Das angegebene Volumen von TRIS-Puffer, der eine blaue Lebensmittelfärbung enthielt, wurde in alle Vertiefungen einer 384-Vertiefungsplatte unter Verwendung der Pipette abgegeben. Nach dem Abgeben des gefärbten Farbstoffs wurden 50 microl TRIS-Puffer in jede Vertiefung unter Verwendung des Abgabeverteilers mit einer Geschwindigkeitseinstellung von 5 gegeben. Die Absorption bei 595 nm für jede Vertiefung jeder Platte wurde unter Verwendung eines Mikroplatten-Absorptionslesers bestimmt. Beachten Sie, dass jede Datenleiste die CV einer ganzen Platte darstellt. Abbildung 7: Dosiergenauigkeit in partiell gefüllte 96-Well-Platten mit der Precision 2000-Pipette bei verschiedenen Dosiervolumina. In jede Vertiefung einer Platte wurden 100 Mikroliter QC-Prüflösung 3 unter Verwendung der Pipette als Verdünnungsmittel abgegeben. Als nächstes wurde das angegebene Volumen des gelben Farbstoffs in alle Vertiefungen einer Platte mit 96 Vertiefungen unter Verwendung der Pipette abgegeben. Die Absorption bei 450 nm für jede Vertiefung jeder Platte wurde unter Verwendung eines PowerWaveX-Mikroplatten-Spektrophotometers (BioTek Instruments, Winooski, VT) bestimmt. Beachten Sie, dass jede Datenleiste die CV einer ganzen Platte darstellt. Abbildung 8: Dosiergenauigkeit in trockene 96- oder 384-Well-Platten mit dem Precision 2000-Verteiler bei verschiedenen Dosiervolumina. Das angegebene Volumen von TRIS-Puffer, der eine blaue Lebensmittelfärbung enthielt, wurde an alle Vertiefungen einer entweder 96- oder 384-Vertiefungsplatte unter Verwendung des Verteilers abgegeben. Nach dem Abgeben des gefärbten Farbstoffs wurde die Pufferflasche nur in den TRIS-Puffer gewechselt, und entweder 100 ml oder 50 ml TRIS-Puffer wurden in jede Vertiefung der 96- oder 384-Well-Platten jeweils unter Verwendung des Verteilers bei einer Geschwindigkeitseinstellung von 5 gegeben. Die Extinktion bei 595 nm für jede Vertiefung jeder Platte wurde unter Verwendung eines Mikroplatten-Absorptionslesers bestimmt. Beachten Sie, dass jede Datenleiste die CV einer ganzen Platte darstellt. Diskussion Diese Daten zeigen, dass die Präzision 2000 verwendet werden kann, um die kleinen wässrigen Volumina, die für die Mikroarray-Probenvorbereitung notwendig sind, präzise und genau abzugeben. Die Verwendung des Pipettenarms ermöglicht unbegrenzte Flexibilität in Bezug auf Flüssigkeitstransfer. Der in der Precision 2000rsquos Rapid Dispense Mode Option verwendete Verteiler ist auch sehr nützlich für kleinvolumige Dosierungen. Dieses Massenreagensabgabeverteiler hat den Vorteil, daß es sehr schnell ist, und ist sehr nützlich, wenn es bis zu so wenig wie 10 Mikroliter pro Vertiefung ausgegeben wird. Mehrere Faktoren beeinflussen die Fähigkeit, kleine Volumina mit dem Precision 2000 zu verteilen. Die Verdrängungsspritzen hängen von der Verlagerung von Luft ab, um das Fluid aus dem Fass der Spitze zu drücken. Unglücklicherweise sind gasförmige Materialien im Gegensatz zu Flüssigkeiten anfällig für Kompression, was nahelegen würde, daß die Genauigkeit bei großen Volumina (z. B. 100 & mgr; l) stattfindet, wo der Großteil der Säule flüssig ist. Dies schließt oft die Fähigkeit aus, bei deutlich kleineren Volumina genau zu sein. Da Luft auch aufgrund von Temperaturänderungen anfällig für Expansion und Kontraktion ist, werden Proben und Reagenzien, die auf Umgebungstemperatur äquilibriert sind, zu einer genaueren und präzisen Abgabe führen. Für die genauesten und präzisesten Dosierungen ist es ratsam, eine erste Vorabnahme eines kleinen Volumens vorzunehmen. Dies stellt eine gewisse Kompensation für die Kompression des Luftgases bereit und stellt auch eine feuchte Umgebung innerhalb der Pipettenspitze bereit. Die Abgabe in eine Flüssigkeit ist im Allgemeinen genauer und genauer als die Abgabe in eine leere Wanne. Dieses Phänomen ist höchstwahrscheinlich aufgrund der kleinen Menge der Flüssigkeiten, die auf die Außenseite der Pipettenspitze einwirken und nicht in die Vertiefung abgegeben werden. Beim Abgeben in eine bereits vorhandene Flüssigkeit ist es wahrscheinlicher, dass diese Flüssigkeit aufgrund der Oberflächenspannung in das Fluid dispergiert wird als auf die Spitze. Das Präzisions-2000-Mikroplatten-Pipettiersystem ist ein präzises und präzises Flüssigkeits-Handhabungssystem, das die meisten Routine-Pipettier-, Abgabe - und Verdünnungsanwendungen automatisieren kann. Ideal für ein flexibles und vielseitiges automatisiertes System mit geringem Platzbedarf. Es hat sich als sehr platzierfähiges Pipettiergerät (1 Mikrolinie) erwiesen, um heutigen niedrigen Assayvolumina gerecht zu werden. Die Flexibilität und Beweglichkeit dieses Systems ermöglicht es auch, viele der manuellen Pipettieraufgaben, die für das Microarray-Spotting erforderlich sind, zu automatisieren. Referenzen Held, P. und Cohen, D. (2000) Mit BioTekrsquos Precision 2000 zur Verteilung kleiner Volumina. Anwendungshinweise, BioTek Instruments Inc. Highland Park, Box 998 Winooski, VT 05404, biotek TradeMarks und Copyrights Precision 2000, Precision Power, PowerWave sind alle Marken der BioTek Instruments, Winooski, VT. 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